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竞争ELISA测抗体亲和力实验流程
日期：2025-05-03 02:46
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摘要：
包被抗原板，然后用3%的MPBS室温封闭2h，PBS洗涤。
在一排试管中，利用有限稀释法建立从0.1 nmo/L~1μmol/L浓度梯度的抗原PBS溶液，加入抗体溶液（浓度≤0.5μmol/L）使总体积为100μl。
室温孵育30min后，加90μl反应混合物到前述已包被抗原的微孔中，微孔中预先加人30%的MPBS 30μl后孵育，但时间不宜超过10min（时间不宜过长，过长会导致混合物中反应平衡体系被破坏，zui 终实验数据不准确）。充分洗涤抗原板。
加入酶标二抗，孵育1h，PBS洗涤。
加入显色底物显...
- 包被抗原板，然后用3%的MPBS室温封闭2h，PBS洗涤。
- 在一排试管中，利用有限稀释法建立从0.1 nmo/L~1μmol/L浓度梯度的抗原PBS溶液，加入抗体溶液（浓度≤0.5μmol/L）使总体积为100μl。
- 室温孵育30min后，加90μl反应混合物到前述已包被抗原的微孔中，微孔中预先加人30%的MPBS 30μl后孵育，但时间不宜超过10min（时间不宜过长，过长会导致混合物中反应平衡体系被破坏，zui 终实验数据不准确）。充分洗涤抗原板。
- 加入酶标二抗，孵育1h，PBS洗涤。
- 加入显色底物显色，显色30min后加入终止液停止反应，进行OD值读数。
- 抗原浓度较低时，反应平衡后[A]较大，被抗原板捕获的游离抗体多，信号强;当抗原浓度高时，反应平衡后[A]较小，被抗原板捕获的游离抗体少，信号弱;当抗原浓度髙到一定程度时，将没有信号。在zui 强信号一半时的状态为半饱和状态，此时[A]=[AB]，Kd=[B]≈[B]总。将测得的OD值记录，结合梯度稀释的抗原浓度绘制拟合曲线，zui 终找到zui 强信号一半的点，对应的抗原浓度即解离常数Kd。