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荧光定量PCR对标准品要求
日期：2025-06-09 10:39
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摘要：荧光定量PCR对标准品要求
荧光定量PCR检测的是起点荧光值，定量分析的是未经PCR放大之前的起始模板量。
这就涉及到荧光定量PCR的第2个关键点——定量方式的选择：相对定量和绝dui定量。
绝dui定量可测定目的基因在样本中的具体拷贝数，相对定量测定的是目的基因在两个或多个样本中的相对表达水平，定量方式的选择取决于实验目的。
绝dui定量必须使用已知浓度/拷贝数的标准品制作标准曲线，绝dui定量对标准曲线的准确度要求较高，相对来说对标准品的要求也比较高。标准品的要求：
（1）标准品与待测样本用相同的引物进行扩增，确保引物在两者中扩增效率相同。
（2）标准品来源可以是基因组DNA，质粒DNA，纯化的PCR产物，Total RNA（cDNA），体外转录的 RNA等，其中基因组DNA和Total RNA（cDNA）不能直接用作标准品。
（3）标准品必须经过准确定量，其拷贝数必须已知。
（4）标准品与待测样本要在同一次实验以及相同的条件下完成，扩增效率尽量接近。
标准曲线的制作:
将标准品稀释5~6个浓度梯度，稀释倍数可以选择5倍（cDNA）或10倍（质粒DNA、体外转录RNA）。